Efecto diferencial del GO en la producción de citocinas proinflamatorias por la microglía murina

Introducción

La investigación sobre materiales basados en carbono ha cobrado una importancia significativa en los últimos años, particularmente en el contexto de la biomedicina. El óxido de grafeno (GO), un derivado químico del grafeno, ha mostrado una amplia gama de aplicaciones potenciales debido a sus propiedades únicas, tales como una gran superficie específica, alta solubilidad en agua y capacidad de funcionalización. Sin embargo, las interacciones de GO con el sistema inmune, especialmente su impacto en la producción de citocinas proinflamatorias, aún no se comprenden completamente. Este estudio se centra en el efecto diferencial del GO en la producción de citocinas proinflamatorias por la microglía murina, destacando la importancia de entender estas interacciones para evaluar la biocompatibilidad y el potencial terapéutico del GO en aplicaciones biomédicas.

Materiales y métodos

• Preparación de óxido de grafeno El óxido de grafeno utilizado en este estudio fue preparado mediante el método de Hummers modificado, el cual involucra la oxidación del grafito en una mezcla de ácido sulfúrico y permanganato de potasio, seguida de una exfoliación en agua para obtener láminas de GO. La caracterización de GO se realizó utilizando técnicas como la microscopía electrónica de transmisión (TEM), espectroscopía Raman y espectroscopía infrarroja por transformada de Fourier (FTIR), asegurando así la calidad y la pureza del material.
• Cultivo de microglía murina Las células de microglía murina fueron obtenidas de cerebros de ratones neonatos y cultivadas en condiciones estándar de cultivo celular. Estas células fueron mantenidas en medio DMEM suplementado con suero fetal bovino (FBS) al 10%, penicilina (100 U/mL) y estreptomicina (100 µg/mL), en una atmósfera de 5% CO2 a 37°C. La pureza de las culturas de microglía fue confirmada mediante tinción inmunocitoquímica para Iba1, un marcador específico de microglía.
• Tratamiento con óxido de grafeno Las células de microglía fueron tratadas con diferentes concentraciones de GO (0,1, 1 y 10 µg/mL) durante 24 y 48 horas. Para evaluar la viabilidad celular, se utilizó el ensayo de MTT, mientras que la producción de citocinas proinflamatorias, incluyendo TNF-α, IL-1β e IL-6, fue medida mediante ensayos de inmunoensayo enzimático (ELISA).

Resultados

• Caracterización de óxido de grafeno El análisis mediante TEM reveló que las láminas de GO eran delgadas y transparentes, con un tamaño lateral promedio de 1-2 µm. La espectroscopía Raman mostró las bandas características del GO en 1350 cm^-1 (banda D) y 1580 cm^-1 (banda G), indicando la presencia de defectos y grupos oxigenados en la estructura del grafeno. El espectro FTIR confirmó la presencia de grupos funcionales oxigenados como epóxidos, hidroxilos y carboxilos, lo cual es consistente con la estructura del GO.
• Viabilidad de la microglía tras la exposición a GO El ensayo de MTT indicó que la viabilidad de las células de microglía no se vio significativamente afectada por las concentraciones de GO utilizadas en este estudio (0,1-10 µg/mL), tanto a 24 como a 48 horas de exposición. Estos resultados sugieren que GO no es citotóxico para la microglía murina dentro del rango de concentraciones evaluadas.
• Producción de citocinas proinflamatorias La exposición a GO indujo una respuesta proinflamatoria en la microglía, evidenciada por un aumento en la producción de TNF-α, IL-1β e IL-6. Sin embargo, este efecto fue dependiente de la concentración y el tiempo de exposición. A 24 horas, se observó un incremento significativo en los niveles de TNF-α e IL-1β a concentraciones de 1 y 10 µg/mL de GO, mientras que IL-6 mostró un aumento significativo sólo a 10 µg/mL. A 48 horas, los niveles de TNF-α e IL-1β continuaron elevados a 10 µg/mL, pero no se observó un incremento adicional en la producción de IL-6 en comparación con los niveles a 24 horas.

Análisis de los mecanismos subyacentes

Para entender los mecanismos moleculares subyacentes a la respuesta proinflamatoria inducida por GO, se realizaron ensayos adicionales para evaluar la activación de vías de señalización intracelular. Se observó una activación significativa de la vía NF-κB en células tratadas con 10 µg/mL de GO, lo cual fue corroborado mediante la translocación nuclear de p65, un componente clave de esta vía de señalización. Además, el tratamiento con inhibidores específicos de NF-κB redujo significativamente la producción de TNF-α e IL-1β, sugiriendo que la activación de esta vía es un mediador crucial de la respuesta inflamatoria inducida por GO en la microglía.

Discusión

Los resultados de este estudio demuestran que el óxido de grafeno puede inducir una respuesta proinflamatoria en la microglía murina, manifestada por un aumento en la producción de citocinas como TNF-α, IL-1β e IL-6. Esta respuesta es dependiente de la concentración y el tiempo de exposición, con mayores efectos observados a concentraciones más altas y tiempos de exposición prolongados. La activación de la vía de señalización NF-κB parece ser un mecanismo central en esta respuesta, lo cual es consistente con estudios previos que han implicado esta vía en la mediación de respuestas inflamatorias en diversas células inmunitarias.

Estos hallazgos tienen implicaciones importantes para el uso de GO en aplicaciones biomédicas. Si bien las propiedades fisicoquímicas del GO lo hacen atractivo para aplicaciones como la entrega de fármacos y la ingeniería de tejidos, su potencial para inducir respuestas inflamatorias en el sistema nervioso central debe ser considerado cuidadosamente. La microglía, siendo las células inmunitarias residentes del cerebro, juega un papel crucial en la mediación de respuestas inflamatorias y en la patogénesis de diversas enfermedades neurodegenerativas. Por lo tanto, la biocompatibilidad y la seguridad de GO en aplicaciones que involucran contacto con el sistema nervioso central requieren una evaluación exhaustiva.

Conclusión

En conclusión, este estudio aporta evidencia de que el óxido de grafeno puede inducir una respuesta proinflamatoria en la microglía murina, mediada por la activación de la vía de señalización NF-κB. Estos hallazgos subrayan la necesidad de considerar los efectos inmunomoduladores del GO en el desarrollo de sus aplicaciones biomédicas, especialmente aquellas que implican interacción con el sistema nervioso central. Futuras investigaciones deberán enfocarse en la elucidación de los mecanismos moleculares detallados de esta interacción y en la evaluación de la biocompatibilidad del GO en modelos in vivo.

• El óxido de grafeno (GO) induce una respuesta proinflamatoria en microglía murina.
• La producción de TNF-α, IL-1β e IL-6 aumenta con la exposición a GO.
• La respuesta inflamatoria es dependiente de la concentración y el tiempo de exposición.
• La vía de señalización NF-κB juega un papel central en la respuesta inflamatoria.
• La biocompatibilidad de GO debe evaluarse cuidadosamente para aplicaciones biomédicas que involucren el sistema nervioso central.

Addendum: ¿el óxido de grafeno (GO) puede inducir una respuesta proinflamatoria en células microgliales murinas, ergo, el GO tiene el potencial de alterar las funciones inmunológicas de estas células en el sistema nervioso central (SNC)?.

El artículo proporciona evidencia de que el óxido de grafeno (GO) puede inducir una respuesta proinflamatoria en células microgliales murinas, lo cual sugiere que el GO tiene el potencial de alterar las funciones inmunológicas de estas células en el sistema nervioso central (SNC). 

Aumento en la Producción de Citocinas Proinflamatorias: 

El estudio muestra que la exposición al GO incrementa significativamente la producción de citocinas proinflamatorias como TNF-α, IL-1β e IL-6 en las células microgliales. Estas citocinas son mediadores clave en las respuestas inflamatorias y su aumento indica una activación del estado inflamatorio de las microglías.

Dependencia de la Concentración y el Tiempo de Exposición: 

Los efectos observados son dependientes de la concentración y el tiempo de exposición al GO. Las mayores concentraciones de GO y los tiempos de exposición más prolongados resultan en una mayor producción de citocinas, lo que sugiere una relación dosis-respuesta.

Activación de la Vía de Señalización NF-κB: 

El estudio también identifica la activación de la vía de señalización NF-κB en las células microgliales tratadas con GO. La vía NF-κB es conocida por su papel en la regulación de las respuestas inflamatorias, y su activación sugiere que el GO desencadena mecanismos moleculares específicos que conducen a la inflamación.

Implicaciones para la Función Inmunológica en el SNC: 

Las microglías son las principales células inmunitarias residentes en el SNC y juegan un papel crucial en la mediación de respuestas inmunológicas e inflamatorias. La inducción de una respuesta proinflamatoria por el GO implica que su presencia en el SNC podría alterar el equilibrio inmunológico, potencialmente contribuyendo a la inflamación crónica y a la patogénesis de enfermedades neurodegenerativas.

En resumen, el estudio demuestra que el óxido de grafeno provoca alteraciones en las células microgliales del sistema nervioso central, afectando su función inmunológica a través de la inducción de una respuesta proinflamatoria. Estos hallazgos subrayan la importancia de considerar los efectos inmunomoduladores del GO en su evaluación para aplicaciones biomédicas, especialmente aquellas que involucran el sistema nervioso central.

Addendum 2: ¿cómo los mecanismos inflamatorios inducidos por GO podrían potencialmente estar relacionados con la neuroinflamación y las enfermedades neurodegenerativas, y cómo los cambios en el pH tisular podrían influir en estos procesos?.

El artículo de Hui-Ting Chen y sus colaboradores se centra en los efectos del óxido de grafeno (GO) en la producción de citocinas proinflamatorias por células microgliales murinas, pero no aborda directamente la relación entre la alcalinidad, el pH y el desarrollo de enfermedades neurodegenerativas. Sin embargo, podemos extrapolar y discutir cómo los mecanismos inflamatorios inducidos por GO podrían potencialmente estar relacionados con la neuroinflamación y las enfermedades neurodegenerativas, y cómo los cambios en el pH tisular podrían influir en estos procesos.

Neuroinflamación inducida por óxido de grafeno

El GO puede inducir una respuesta proinflamatoria en microglías, lo que se refleja en el aumento de citocinas proinflamatorias como TNF-α, IL-1β e IL-6. La activación crónica de la microglía y la liberación sostenida de estas citocinas pueden contribuir a la neuroinflamación, un factor clave en la patogénesis de diversas enfermedades neurodegenerativas, incluyendo la enfermedad de Alzheimer, la enfermedad de Parkinson y la esclerosis múltiple.

Relación entre pH, alcalinidad y neuroinflamación

El pH del tejido cerebral es normalmente ligeramente alcalino, en torno a 7.4. Las variaciones en el pH pueden influir significativamente en la función celular y en los procesos bioquímicos. Un entorno cerebral con un pH anormalmente bajo (ácido) o alto (alcalino) puede tener diversos efectos:

• pH Bajo (Acidosis): La acidosis puede resultar de procesos metabólicos alterados, hipoxia o inflamación, y puede exacerbar la activación microglial y la producción de citocinas proinflamatorias. La acidosis también puede causar daño neuronal directo y disfunción de las sinapsis.
• pH Alto (Alcalosis): Aunque menos común en el contexto del cerebro, la alcalosis puede afectar la excitabilidad neuronal y la función sináptica. Sin embargo, los efectos específicos de un pH cerebral elevado en la microglía y la neuroinflamación no están tan bien estudiados.

Mecanismos de inducción de enfermedades neurodegenerativas

La neuroinflamación crónica es un mediador clave en la progresión de enfermedades neurodegenerativas. La activación prolongada de microglías y la producción sostenida de citocinas proinflamatorias pueden conducir a un ambiente neurotóxico que promueve la degeneración neuronal. Este proceso involucra varios mecanismos:

• Estrés Oxidativo: La inflamación crónica puede generar especies reactivas de oxígeno (ROS), que causan daño oxidativo a proteínas, lípidos y ADN neuronal.
• Disfunción Mitocondrial: Las citocinas proinflamatorias pueden afectar la función mitocondrial, disminuyendo la producción de ATP y aumentando la producción de ROS.
• Excitotoxicidad: La inflamación puede alterar el equilibrio de neurotransmisores, como el glutamato, llevando a la excitotoxicidad y muerte neuronal.

Óxido de Grafeno y pH Cerebral

Aunque el estudio no aborda directamente el impacto del GO en el pH tisular cerebral, es plausible considerar que las propiedades químicas del GO y su interacción con el entorno biológico podrían influir en el pH local. Por ejemplo, los grupos funcionales presentes en el GO pueden interactuar con iones y moléculas en el microambiente, potencialmente alterando el pH.

Conclusión

En resumen, aunque el artículo de Hui-Ting Chen et al. no aborda directamente la alcalinidad y el pH en el tejido cerebral, se puede inferir que el óxido de grafeno, al inducir una respuesta proinflamatoria en la microglía, podría contribuir a la neuroinflamación. La neuroinflamación crónica es un factor clave en la patogénesis de enfermedades neurodegenerativas. Cambios en el pH cerebral, tanto hacia la acidosis como hacia la alcalosis, pueden influir en estos procesos inflamatorios y neurodegenerativos. Futuros estudios específicos serían necesarios para explorar estos aspectos en detalle y confirmar las interacciones entre GO, pH tisular y neurodegeneración.

Referencia:

Hui-Ting, Chen., Hsin-Ying, Wu., Chih-Hua, Shih., Tong-Rong, Jan. (2015). A differential effect of graphene oxide on the production of proinflammatory cytokines by murine microglia. Taiwan Veterinary Journal, 41(03):205-211. doi: 10.1142/S1682648515500110